开发用于巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)遗传操作的电转化方案

开发用于巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)遗传操作的电转化方案(中文14000字,英文PDF)
摘要
背景：原料成本是大多数发酵生物过程中最大的成本，因此是降低成本的重要目标。同时，生物炼制概念主张通过完全利用生物燃料生产过程中产生的副产品来实现收入增长。总的来说，低成本粗甘油是生物乙醇生产过程的副产品，供应过剩，以其为原料生产生物燃料，为推进低成本生物燃料的开发提供了极好的机会。然而，很少有细菌物种具有将甘油作为碳和能源的唯一来源转化为增值生物产品的天然能力。值得注意的是，厌氧菌Clostridium pasteurianum是唯一已知将甘油单独转化为丁醇的微生物，目前作为高能生物燃料和散装化学品具有巨大潜力。不幸的是，由于缺乏有效的脱氧核糖核酸（DNA）转移方法，该菌株的遗传和代谢工程已经从根本上受到阻碍。
结果：该工作开发了一种高效电转化巴氏梭菌ATCC 6013实现高水平DNA转移的方案的，同时对选择标记和载体类型进行了筛选。研究表明CPAAI限制性修饰系统是影响巴氏杆菌DNA转运的主要障碍。我们用m.fnudii甲基转移酶克服了识别位点（5’-cgcg-3’）的体内甲基化修饰的屏障。通过适当选择复制起点和抗生素抗性标记，我们首先实现了将甲基化DNA电穿孔到巴氏梭菌，效率低，转化率2.4×101。进而通过系统研究细胞生长，洗涤和电转化以及电转化过程的生长阶段的各种参数显着提高了电转化效率，高达7.5×104个转化体每μg-1DNA，增加了约三个数量级。此外结果表明影响电转化效率的关键因素包括使用甘氨酸的细胞壁减弱，乙醇介导的膜溶解，电转的场强和蔗糖渗透保护。
结论：使用适当的甲基化质粒DNA，可以高效率地电转化巴氏梭菌ATCC 6013。这里报道的电转化方法和工具应该促进这种生物技术广泛运用于遗传操作和代谢工程。
关键词：生物燃料；丁醇；基因工程；电穿孔法；甘油；甲基化；限制性转化